نکاتی از هیستوتکنیک

دانشجویان عزیز :

مواردی که درزیرنگاشته شده مطالب بسیارمهم در مورد نمونه های پاتولوژی  است و بکاربردن آن برای  رسیدن به تشخیص صحیح و دقیق ضروری است 
بررسی پاتولوژیک نمونه های بدست آمده از بدن از مهمترین عوامل تشخیص بیماریها میباشد برای آنکه از این نمونه ها  بتوان به بهترین نحو برای تشخیص بیماریها استفاده نمود لازم است به نکاتی چند در مورد نمونه برداری و ارسال نمونه که در زیر اشاره می شود دقت خاص نمود

نکاتی که باید قبل از نمونه برداری مد نظر باشد

الف – هدف از نمونه برداری 
از انجا که هدف از نمونه برداری رسیدن به یک تشخیص قطعی با توجه به یافته های  بالینی است، چنانچه قبل از نمونه برداری تشخیص های محتمل مطرح و ارائه گردد. امکان ارائه پاسخ صحیح و کامل بسیار بیشتر خواهد بود.

ب – دادن اطلاعات لازم به پاتولوژیست ها

برخی پزشکان تصور میکنند که اصولا" پاتولوژیست بایستی با توجه به یافته های خود گزارش پاتولوژی را بنویسد و دادن اطلاعات به او نه تنها ضرورتی ندارد بلکه ممکن است باعث اشکال در تصمیم گیری وی شود.هرچند بررسی پاتولوژی آنقدر قطعی هست که بتواند در بسیاری از موارد چنین خواسته ای را برآورده سازد. اما موارد خاصی هم وجود دارد که نمیتوان بدون داشتن اطلاعات کافی به این خواسته رسید که در زیر به  چند مورد آن اشاره می شود.
- هیچ کس نمی تواند احتمال جابجایی را در یک پروسه کاری چند مرحله ای انکار نماید منابع شایعی از این خطاها میتواند تشابه اسمی، برچسب اشتباه یا یک اشتباه ساده تایپی باشد. میتوان با کنترل و مطابقت یافته های بالینی و پاتولوژیک احتمال این خطاها را به حداقل رساند.
- برخی از ضایعات پاتولوژیک در حد بینابینی می باشند و چند تشخیص پاتولوژیکی دارند.در این موارد اطلاعات بالینی برای رسیدن به نتیجه درست ضروری است.
 - برخی بیماری ها ممکن است بشکل محدود و ظریف در نمونه وجود داشته باشد مثل پیداکردن جسم لشمن در یک نمونه رقیق از مغز استخوان که نیازمند صرف وقت زیاد بوده و تشخیص تنها در صورت داشتن ظن بالینی قوی در چنین نمونه ای امکانپذیر می باشد.
- گاهی نمونه ارسالی کوچک بوده یا عمدتا" از خون یا مواد نکروتیک تشکیل یافته است. در چنین مواردی نیز ظن بالینی ممکن است در یافتن یک ضایعه خاص کمک کننده باشد.
- همانگونه که در بالین نیز اینگونه است  ، گاهی الگوی تداخلی چند بیماری بطور همزمان وجود دارد یا الگوی اصلی بیماری تحت تاثیر عواملی همچون تغییرات فیزیولوژیک، سن یا اثرات درمان های مختلف قرار گرفته است که در صورت نداشتن اطلاعات کافی ممکن است تشخیص نادرستی مطرح گردد. مثلا" در نمونه فردی که قبلا" یکبار FNA   تیروئید برای او انجام شده است ممکن است سلولهای شبیه به سلولهای سرطانی دیده  شود.
 
نکته دوم  : این اطلاعات باید توسط چه کسی داده شود.

لازم است این اطلاعات توسط پزشکی که بیمار تحت درمان اوست و در جریان کلیه اقدامات انجام شده برای بیمار است، صورت گیرد. ولی آنچه که عملا" مشاهده می شود تهیه فرم ارسالی توسط افراد دیگر و با بررسی اجمالی پرونده بوده و عملا" فاقد اطلاعات کمک کننده به پاتولوژیست است. اطلاعات فوق در فرمی به نام فرم شماره ی یک مصوب وزارت بهداشت نوشته می شود که در بخش ضمیمه آورده شده است

تنها پزشک معالج یا فردی مشابه اوست که می تواند در چند جمله کوتاه مهمترین یافته های مرتبط با بیماری را برای  پاتولوژیست تشریح نماید.
نکاتی که باید قبل از نمونه برداری مد نظر باشد

الف- نحوه نمونه برداری 
با توجه به دیدگاه دقیق بالینی که اهمییت آن ذکر شد بایستی در موارد زیر تصمیم گیری شود:
- انتخاب روش صحیح نمونه برداری 
بطور مثال در بیماری میلوم مولتیپل آسپیراسیون مغز استخوان کفایت میکند ولی برای تشخیص آنمی آپلاستیک بیوپسی مغز استخوان ضروری است.

انتخاب محل نمونه برداری

بطور مثال گاهی مرکز و گاهی محیط ضایعه و گاهی هر دو ناحیه بایستی بیوپسی شوند. گاهی ضایعات جدید و گاهی ضایعات قدیمی دارای یافته های خاص هستند. ضخامت نمونه با توجه به تشخیص های مطرح شده متفاوت است مثلا" برای تشخیص پانیکولیت ها ( التهاب هیپودرم )لازم است تا عمق هیپودرم نمونه برداری شود. گاهی لازم است برای بررسی تغییرات ، نمونه ای از منطقه غیر گرفتار هم داشته باشیم. گاهی در برخی نواحی تغییرات ثانویه اتفاق می افتد که الگوی اصلی بیماری را تحت تاثیر قرار می دهد.
در صورتی که بررسی حاشیه ی جراحی مد نظر باشد پزشک باید حاشیه ها را توسط نخ های کوتاه و بلند یا هر روش معقول دیگری مشخص نماید

 

مقدار و تعداد قطعات برداشته شده

مسلما" هر چه مقدار یا تعداد نمونه بافتی بیشتری در اختیارداشته باشیم ارزیابی دقیق تری را می توانیم انجام دهیم. ولی با توجه به برخی محدودیت ها مقدار حداقل مثلا" سه یا چهار قطعه می تواند قابل قبول باشد. در ضمن هرچه شدت ضایعه غیر یکنواخت تر باشد یا مواردی مثل نکروز در آن وجود داشته باشد. این تعداد حداقل افزایش می بابد. گاهی اتفاق می افتد که جراح پس از لاپاروتومی متوجه یک ضایعه پیشرفته و فراگیر می شود که احشاء بسیاری را درگیر نموده است و تنها یک بیوپسی کوچک ارسال می کند و در بررسی پاتولوژیک نیز فقط بافت نکروزه یا فیبروتیک با چند یافته غیر اختصاصی دیده می شود. در چنین مواردی که برداشت یک نمونه بزرگ خطرناک است. میتوان چندین بیوپسی کوچک از چندین کانون مختلف تهیه کرد.

 

نحوه خارج کردن نمونه

خارج کردن نمونه بایستی با حداقل ترومای وارده به بافت باشد. در مورد بافتهای مثل عقده لنفاوی این مسئله از چند نظر اهمیت دارد. اول آنکه هم بافت پشتیبان و هم سلولهای لنفاوی چه در حالت واکنشی و جه در حالت نئوپلاستیک ظریف و شکننده می باشند بنابراین با کوچکترین تروما تغییرات ناخواسته آرتیکفت در نمونه ظاهر می شود و از طرفی نکات افتراق ضایعات نئوپلاستیک از غیر نئوپلاستیک بسیار ظریف است بنابراین برای تشخیص صحیح آنها از یگدیگر لازم است نمونه ای مناسب داشته باشیم . در ضمن توجه داشته باشیم که این راه تشخیصی ممکن است تنها راه رسیدن به تشخیص یک بیماری مرموز باشد.

بهتراست بیوپسی غدد لنفاوی توسط افراد کاملا" مجرب صورت گیرد و اگر مهارت ندارد بهتر است به پزشک دیگری واگذار نماید

- گاهی نمونه بردار(جراح)نمونه  را در اطاق عمل تشریح می نماید این کار ممکن است یافته های ماکروسکوپی را که همانند یافته های ماکروسکوپی از اهمیت خاص برخوردار است مغشوش سازد و از طرفی پاتولوژیست نتواند در مورد جهت گیری صحیح برای تهیه مقاطع بافتی تصمیم گیری نماید.

گاهی نمونه بردار نمونه را به دو قسمت تقسیم می نماید و به دو مرکز مختلف ارسال می نماید. اصولا" این کار صحیح نبوده و حداقل می تواند دو اشکال زیر را ایجاد نماید:
- ممکن است تشخیص صحیح موقعی صورت گیرد که یافته های هر دو نمونه در کنار هم قرار گیرند و هیچکدام به تنهایی بیانگر کل ضایعه نباشند.
ممکن است فقط یکی از نمونه ها دارای یافته های تشخیصی باشد. بنابراین ممکن یک بررسی سوم نیز ضرورت پیدا کند.

ب – نحوه ارسال نمونه 
 ظرف حاوی نمونه بایستی خصوصیات زیر را داشته باشد
-محکم و نشکن باشد
- در مورد نمونه های متوسط و بزرگ دهانه گشادی داشته باشد که بدون نیاز به فشردن بافت بتوان آن را در ظرف وارد و یا از آن خارج کرد.
- در مورد نمونه های کوچک شفاف باشد تا پزشک نمونه بردار و یا مسئول پذیرش نمونه، بدون نیاز به بازکردن ظرف از وجود نمونه در ظرف اطمینان حاصل کنند.
- ظرف تمیز و ترجیحا" نو باشند یا حداقل قبلا" موادی شیمیایی مثل وایتکس در آنها قرار نگرفته باشد.
- درب ظرف محکم باشد تا در حین حمل ونقل نمونه یا فیکساتیو از آن خارج نشود.
- از ظرف های بسیار کوچک که احتمال گم شدن آنها با چسبیدن نمونه به درب آن و دور ماندن از ماده فیکساتیو وجود دارد استفاده نشود.
ارزش مادی تهیه یک ظرف مناسب برای نمونه ای که با یک عمل تهاجمی بدست آمده است
بسیار کمتر از اشکالاتی است که برای نمونه ممکن است پیش آید و مانع از تشخیص صحیح گردد.

ماده فیکساتیو : 
با توجه به نوع نمونه و نوع بررسی میتوان از فیکساتیو های مختلف استفاده نمود. فیکساتیوی که بطور معمول استفاده می شود فرمالین ده درصد است که بهتر است آن را بشکل آماده از بخش پاتولوژی تهیه نمود.
حجم فیکساتیو : 
- باید به حدی باشد که نمونه کاملا" در داخل آن غوطه ور شود (پنج تا ده برابر حجم نمونه )
- در صورت عدم استفاده از ماده فیکساتیو پدیده غیر قابل برگشت اتولیز رخ می دهد و ارزیابی پاتولوژیک را مشکل و یا غیر ممکن میسازد.
ارسال نمونه در داخل آب یا سرم فیزیولوژی نه تنها مانع اتولیز نمی شود بلکه آنرا تشدید می سازد

باید توجه کرد که خصوصیات ظاهری آب یا سرم فیزیولوژی در یک نمونه داخل ظرف دربسته مشابه با فرمالین است و تا وقتی اتولیز اتفاق نیفتاده باشد کسی متوجه آن نمی شود.
- نمونه های که در فیکساتیو ارسال می شوند برای بررسی کشت میکروبی مناسب نمی باشند بنابراین اگر قصد بررسی میکروبی را نیز دارید از قبل تمهیدات آنرا فراهم کنید.

هدف از فيكس‌كردن بافت
- جلوگيري از تجزيه بافت توسط آنزيم‌هاي موجود در بافت
- جلوگيري از تجزيه بافت توسط باكتري‌ها
- جلوگيري از تغييرات فيزيكي و حفظ شكل و ساختمان بافت
- تغيير درجه انكسار بافت‌ها جهت تفكيك ساختمان‌هاي داخلي مختلف بافت از يكديگر
عوامل مؤثر بر فيكساسيون: 
- تازه‌بودن نسج
- ضخامت نمونه (2 ميلي‌متر)
- انتخاب صحيح فيكساتيو
- درجه حرارت
- مدت زمان فيكساسيون
- PH
انواع فيكساتيوها:
- الف) ساده: الكل‌ها- اسيد پيكريك- فرمالدئيد- اسيدكروميك- اسيد اسميك و ... . 
- ب) مركب: بوئن- زنكر- كارنوز  شوادين
- معمولاً فيكساتيوهاي مركب از ساده بهتر هستند.
تقسيم‌بندي جهت نوع مطالعه:
- الف) مطالعه بافت
- ب) سيتولوژي
- ج) هيستوشيمي 
فيكساتيوهاي مهم:
- فرمالدئيد: ماده‌اي گازي و حلال در آب است كه در کارخانه با حل كردن آن در آب محلول غليظ 40-36 درصد تهيه مي‌كنند. جهت مصرف پاتولوژي از اين ماده محلول 10% (1:10 رقت) تهيه مي‌كنند و جهت خنثي‌سازي مقاديري به آن كلريد سديم يا كربنات سديم اضافه مي‌نمايند.
- فرمالين با عوامل NH2 تركيب مي‌شود. فرمالين تمامي تشكيلات داخلي سلولي از جمله چربي‌ها را حفظ مي‌كند. 
- الكل‌ها و اتانول‌ها: غلظت 100-90% استفاده مي‌شود: آلبومين- گلوتامين- گليكوژن- آهن و اسيد اوريك را حفظ يا فيكس مي‌كند ولي اغلب باعث سختي و چروكيدگي بافت شده محتويات سيتوپلاسمي را جابجا نموده، ميتوكندري را خراب مي‌كند. 
- تترااكسيد اسميوم- اسيد اسميك: 
o بصورت 2% مصرف مي‌شود. جهت ميكروسكوپ الكتروني كاربرد دارد. مسموم كننده است و بايد زير هود كار شود.
o چربي را بخوبي حفظ مي‌نمايد لذا براي تجسس چربي نيز بكار مي‌رود.
- محلول زنكر (Zenker) يا زنكرفمالين (Helly): از بهترين فيكساتيوهاست و تمام تشكيلات دروني سلولي را حفظ مي‌نمايد. براي هماتولوژي نيز مفيد است چون RBC ها را بخوبي حفظ مي‌كند. 
- محلول بوئن: از تركيبات خوب بافت‌شناسي است. حاوي اسيدپيكريك است لذا باعث تخريب گلبول‌هاي قرمز و ميتوكندري مي‌شود لذا بايد 7 ساعت در آن قرار داده سپس با آب شستشودهند تا رنگ زرد آن از بين برود. براي بررسی بافت بيضه و براي بررسی گليكوژن (مثلاً در كبد) مفيد است. 
- فرمولاسيون: اسيدپيكريك اشباع 450 ميلي‌ليتر- فرمالين غليظ 150 ميلي‌ليتر- اسيداستيك غليظ 30 ميلي‌ليتر + حجم کلی با آب مقطر 1000 میلی لیتر
- دكلسيفيكاسيون: چون از استخوان نمي‌توان برش نازك تهيه كرد لذا جهت نرم شدن بايد املاح كلسيم آن را خارج نمود كه به اين عمل دكلسيفيكاسيون مي‌گويند. البته اگر استخوان نرم و واجد املاح كمي باشد مي‌توان با چاقوي انجمادي برش نمود.
- روش: تهيه برش‌هايي با ضخامت 4-2 ميلي‌متر توسط اره مويي 
- فيكساسيون با فرمالين 
- قراردادن در اسيد (جذب كلسيم)
- خنثي كردن اسيد (توسط سولفات سديم 5%) 
- شستشوي كامل
- پاساژ دادن بافت 
- خصوصيات محلول دكلسيفيكاسيون:
o كلسيم را بطور كامل از بافت جدا نمايد.
o آزادي به بافت اصلي وارد نكند.
o در رنگ‌آميزي اختلالي ايجاد ننمايد.
o سرعت عمل لازم را داشته باشد.
روش‌هاي كلسيم گيري:
1) توسط اسيدها
2) تبادل يوني
3) الكتروفورز
1) استفاده از اسيدها:
الف) اسيد نيتريك 5% + 1/0% اوره  بمدت 4-1 روز (اسيد هر روز عوض شود)
اسيد نيتريك سريع‌ترين ماده دكلسيفيه كننده است لذا به پايان دكلسيفيكاسيون بايد توجه نمود كه تورم بافتي ايجاد ننمايد. 
ب) اسيد تري كلرواستيك: 7-5% با يا بدون اسيداستيك: روشي كند است ولي تورم سلولي ايجاد نمي‌نمايد. 
ج) اسيد فرميك آبي: بمدت 7-1 روز 
د) EDTA : به مدت  8-4 هفته: هيچگونه آزار سلولي و تداخل و رنگ‌آميزي ايجاد نمي‌نمايد و اغلب مواد داخل سلولي از جمله آهن- منيزيم و سرب را حفظ مي‌كند.
2) تبادل يوني: استفاده از رزين‌هاي جاذب كلسيم (در صنعت كاربرد دارد)
3) الكتروليز: در محلول اسيدكلريدريك + اسيد فرميك بمدت 4-1 ساعت با ولتاژ 6 ولت 
تست‌هاي بررسي كامل شدن دكلسيفيكاسيون:
- روش‌هاي فيزيكي: مقاومت در برابر ناخن- خراش دادن با سوزن- فشردن با سمت كند تيغ جراحي (در كل روش‌هاي فيزيكي توصيه نمي‌شوند) 
- تست با اشعه x : انجام آن مشكل است.
- روش شيميايي: مناسب و قابل قبول مي‌باشد.
روش: 10 ميلي‌ليتر از محلول دكلسيفيكاسيون + 5 ميلي‌ليتر NaoH 2 نرمال + 1 ميلي‌ليتر اگزالات آمونيوم يا سديم 5%  كدرشدن محلول نشانگر وجود كلسيم و ايجاد اگزالات كلسيم است و كلسيفيكاسيون موقعي پايان يافته است كه در محلول آخري دكلسيفيكاسيون كدورتي مشاهده نشود. 
تهيه سل بلاك از آسپيراسيون مغز استخوان يا مايعات غليظ ديگر بيولوژيك:
از اين نمونه‌ها بايد سريعاً اسمير تهيه و با الكل فيكس نمود مابقي باقيمانده نمونه را به علت ارزشمند بودن مي‌توان فيكس نموده بلوك پاتولوژي تهيه نمود كه سل بلاك مي‌گويند. لذا از اين بلوك مي‌توان برش تهيه و انواع رنگ‌آميزي را روي آن انجام داد . 
بررسي سل بلاك براي هموچگين- ساركوئيدوز- سل- لنفوم- پلاسماسل و ... برخي بيماري‌ها از اسمير ارزشمندتر است .

محلول فيكساتيو براي سل بلاك: 
فرمالين غليظ: 200 ميلي‌ليتر + اسيداستيك غليظ: 165 ميلي ليتر + سولفات سديم: 60 گرم + آب مقطر تا حجم نهايي 1000 ميلي‌ليتر

فيكساسيون و دكلسيفيكاسيون بيوپسي مغز استخوان: 
اسيد فرميك خالص: 25-5 ميلي‌ليتر + آب مقطر 100 ميلي‌ليتر + فرمالئيد غليظ 5 ميلي‌ليتر به مدت 7-1 روز هر روز محلول بايد تعويض گردد. 
فيكساسيون در سيتولوژي:
- اگر نمونه بصورت اسمير مي‌باشد سريعاً در الكل اتانول 95% بمدت 30-15 دقيقه غوطه‌ور گردد يا اسپري پاتوفيكس استفاده گردد. 
- اگر نمونه مايع است مايع بسيار رقيق را مانند ادرار سانتريفوژ نموده از رسوب اسمير تهيه نموده به روش فوق فيكس نمائيد. لزومي ندارد اسمير كاملاً خشك شود در حدي كه مقاديري آب خود را از دست داده به لام چسبيده مي‌توان فيكس نمود.
- نمونه‌هاي غليظ نيازي به سانتريفوژ ندارند.
- اگر امكان تهيه اسمير وجود ندارد ادرار تا چندين ساعت در يخچال قابل نگهداري است اغلب مايعات نيز همچنين ولي CSF بايد سريعاً سانتريفوژ و اسمير تهيه شود. 
- به اكثر مايعات مي‌توان هم حجم آنها اتانول 50% اضافه نمود تا فيكس شود. 
- استثناء: به مايعات پريتوئن- پلور و پريكارد نمي‌توان اتانول اضافه نمود.
- مايعات غليظ اضافي را مي‌توان بعد از تهيه اسمير سل بلاك نمود.

پاساژ يا گردش بافت: 
اين عمل پس از عمل تهيه برش‌هاي بافتي از نمونه كه توسط پاتولوژيست انجام مي‌گردد صورت مي‌گيرد ولي نكاتي در مورد اين نمونه‌ها قابل ذكر است.
تعداد قطعات لازم: با توجه به اندازه نمونه و نوع ضايعه تعداد قطعات برداشتي متفاوت است كه جهت اطلاع بيشتر مي‌توانيد به ضميمه انتهاي كتاب سرژيكال پاتولوژي آورده شده است. 
- نمونه‌هاي ریز حتماً در داخل گاز و اگر خيلي ريز بود داخل دو لايه گاز و كاغذ صافي قرار داده شوند. 
- نمونه‌هاي بسيار ريز: الف) دقت شود گاهي نمونه يا قطعه‌اي از آن در داخل درب ظرف چسبيده و جا مي‌ماند.

ب) نمونه‌هاي ريز ممكن است در حین برش با ميكروتوم مشاهده نشده و از دست برود لذا توصيه مي‌شود يك قطره رنگ ائوزين روي آن چكانده شود.

- مشخص كردن حواشي نمونه: در صورتي كه جراح نياز به بررسي حاشيه خاصي از نمونه را داشته باشد آن حاشيه را توسط مركب مشكي سياه نموده پس از خشك شدن آن اقدام به برش مي‌نمايند.
-  اگر پس از برش اولیه يك نمونه سطح خاصي جهت بررسي نياز باشد سطحي كه نياز به برش نيست (سطح مقابل به برش) را كاملاً سياه نمائيد.

 

نمونه‌هاي برش شده درون سبدهاي فلزي درب‌دار قرار داده شده و در كنار آنها نوشته‌اي توسط مداد مشكي كربني حاوي پيش كد آزمايشگاه- سال- و شماره پاتولوژي نمونه قرار داده مي‌شود. اگر نمونه به بخش‌هاي مشخص ديگر نيز برش شده باشد بصورت جداگانه در سبد قرار مي‌گيرد و در انتهاي شماره فوق با علامت زيرگروه A، B و C و ... يا L, R (چپ و راست) يا ساعت گذاري از 12-1 نوشته مي‌شود.

مثال: (سمپ چپ) L- (نمونه) 120- (سال) 89- (كدآزمايشگاه) G در موارد پاس مجدد علامت RP نيز اضافه مي‌شود.

مراحل پاساژ يا گردش بافت: 
1) برش با ضخامت 2-1 ميلي‌ليتر و حداكثر 4 ميلي‌ليتر
2) ثبوت يا فيكساسيون با فيكساتيو مناسب
3) آب گيري (Dehydration) : به مدت 8-6 ساعت توسط الكل‌ها (معمولاً اتانول)- جهت جلوگيري از آب گيري سريع و ناگهاني كه باعث چروكيدگي بافت مي‌گردد ‌آب‌گيري با عبور از 4 ظرف اتانول 70، 85، 96 و 100 درجه صورت مي‌گيرد و نمونه در هر كدام 5/1 تا 2 ساعت مي‌ماند. 
4) الكل‌گيري يا شفاف‌كردن (Clearing): پارافين در الكل غيرقابل حل است لذا براي نفوذ پارافين به داخل بافت بايد الكل آن گرفته شود. براي اين كار از شفاف‌كننده‌ها مثل گزيلل، روغن سدر، بنزن، تولوئن، تتراكلريد كربن استفاده مي‌شود. شفاف‌كننده رايج گزيلل است و معمولاً 3 ظرف و هر كدام 2 ساعت است.
 نكته: اگر بافت به مدت طولاني در گزيلل بماند، خشك مي‌شود.
5) آغشتگي با پارافين مذاب 60-56 درجه سانتي‌گراد: در دو ظرف و هر كدام 4-2 ساعت قرار داده مي‌شود. 
نكته: 1) جهت جلوگيري از شكنندگي مقاديري موم نيز به پارافين مي‌توان افزود.
        2) درصورت كدر بودن پارافين بايد قبلاً‌ پارافين را ذوب نموده از صافي عبور داد. 
بعد از گذر نمونه‌ها از 5 مرحله فوق كه پاساژ دادن مي‌باشد نمونه داراي قوام مناسب و محتوي پارافين بوده بعد از خروج از دستگاه و جامد شدن آماده بلوك‌گيري مي‌باشد كه در مبحث بعدي توسط ديگر اساتيد تدريس خواهد شد.

تكنيك موزه
نگهداري قطعات پاتولوژي در موزه آسيب‌شناسي يا آزمايشگاه‌هاي آموزشي بيمارستان‌ها امروزه امري ضروري است و جهت آموزش دانشجويان مفيد است. تفاوت مهم نگهداري معمولي يا موزه كردن اين است كه بايد رنگ بافت هم ثابت شود و بمدت خيلي طولاني هم حفظ شود. 
براي نگهداري بافت بايد قطعات تهيه شده را بلافاصله در فرمالين 10% قرار داد تا بعداً به روش زير اقدام به نگهداري آنها گردد. 
روش: كيزرلينگ (Keiserling): 
از سه محلول استفاده مي‌گردد.
كيزرلينگI : براي فيكساسيون 
 II : براي حفظ رنگ بافت‌ها
 III : براي نگهداري بافت‌ها
روش پولورتافت- كيزرلينگ (Pulvertaft-keiserling):
در روش ايشان براي حفظ رنگ بافت در انتها سولفيت هیدروژن سديم را نيز اضافه نمود لذا بافت تا 20 سال رنگ خود را حفظ مي‌نمايد. 
محلول كيزرلينگ I : فرمالين غليظ 400 ميلي‌ليتر + نيترات پتاسيم 30 گرم + استات پتاسيم 60 گرم + آب مقطر تا 2000 ميلي‌ليتر 
محلول كيزرلينگ II : اتانول 80% 
بافت را نيم تا 4 ساعت درون اين محلول قرار مي‌دهند. 
محلول كيزرلينگ III : گليسرين 300 ميلي‌ليتر + استات سديم 100 گرم + فرمالين غليظ 5 ميلي‌ليتر + آب مقطر تا 1000 ميلي‌ليتر     PH=8 
قبل از آن كه درب ظرف محكم شود محلول سولفيت هيدروژن سديم 4/0 درصد به آن اضافه مي‌شود. محلول نهایی بايد كاملاً صاف و شفاف باشد. 
نكته: اگر بافت بزرگ باشد بايد مايع را درون عروق يا داخل بافت تزريق نمود.

فيكساسيون گسترش‌هاي مدفوع: 
محلول شوادين به مدت 30 ثانيه
فرمولاسيون: محلول اشباع شده شوادين در آب 600 ميلي‌ليتر + اتانول 95 درجه 300 ميلي‌ليتر + اسيد استيك غليظ 5 ميلي‌ليتر

بلوك كردن بافت
پس از خروج بافت‌ها از دستگاه تیشو پروسسور و سرد و منجمد شدن آنها قالب‌هاي فلزي بلوك را آماده و ته آنها نيم ميلي‌ليتر پارافين مذاب مي‌ريزند. پس از قرار دادن نمونه ها در ته بلوکها روی آنها پارافين مذاب ريخته پس از انجماد نسبي كاغذ حاوي شماره نمونه را كه در داخل سبد قرار داده شده بود بر روي بلوك قرار مي‌دهند پس از سرد و منجمد شدن كامل بلوك اين برگه روي بلوك چسبيده است و مي‌توان بلوك‌ها را از قالب فلزي آنها جدا نمود.

برش بافت‌ها
برش بافت توسط دستگاهي به نام ميكروتوم انجام مي‌گيرد. ميكروتوم انواع مختلفي دارد كه نوع رايج آن ميكروتوم دوار (Rotary Micro) مي‌باشد. 
اين ميكروتوم از بخش‌هاي زير تشكيل شده است:
الف) پايه اتصال بلوك 
ب) پايه اتصالي چاقوي برش
ج) دستگاه چرخش و حركت بافت و پيچ‌هاي تنظيم كننده آنها 
اين دستگاه دسته‌اي مانند چرخ خياطي دستي دارد و با هر بار چرخش بلوك به اندازه‌اي معين در حال بالا و پائين رفتن به تيغ نزديك مي‌شود و نهايتاً پس از رسيدن به تيغ نوارهاي نازكي حدود 3-2 ميكرون از بافت روي بلوك برش و جدا مي‌شود. 
طرز كار با ميكروتوم : 
  بلوك را در فريزر قرار دهيد تا به دماي زير صفر برسد . 
  بلوك را در جايگاه خودروي ميكروتوم قرار داده پيچ‌هاي نگهدارنده آن را سفت كنيد ولي به حدي كه بلوك را تخريب نكند. 
  چاقوي تيز شده را در جايگاه مخصوص قرار داده آن را طوري تنظيم كنيد كه با سطح برش بلوك تقریبا موازي باشد. زاويه زياد با سطح برش باعث تكه تكه شدن نمونه بريده شده مي‌گردد.
  با چرخش ميكروتوم نواري از برش‌هاي تهيه شده ايجاد نموده اين نوار را با دست و كناره لام گرفته بر روي محلول آب و الكل حدود 35 درصد قرار دهيد. محلول آب و الكل تا حدي چين و چروك‌هاي برش را كاهش مي‌دهد. اين نوار معمولاً حاوي چندين برش از نسج مي‌باشد. 
  طولي از اين برش كه به اندازه حدود 2:3 يك لام باشد را جدا نموده به ظرف آبي كه دماي 45-42 درجه دارد و تيشوفلوت ناميده مي‌شود منتقل نمائيد . گرماي آب باعث باز شدن كامل برش و محو شدن كامل چروك‌ها مي‌گردد ولي اگر بمدت طولاني نمونه در آب گرم قرار گيرد بيش از حد باز شده نازك و تكه‌تكه مي‌گردد. 
  يك عدد لام تميز را به آهستگي زير برش برده و به آرامي برش را روي لام منتقل نمائيد. 
  جهت چسبيدن بهتر برش به لام مي‌توان قبلاً‌ مقدار اندكي محلول آلبومين روي لام بماليد (مخلوطي مساوي از گليسرين + سفيده تخم مرغ + آب مقطر) 
  شماره نمونه را در كناره تحتاني لام توسط قلم الماسه حك نمائيد. 
  معمولاً با توجه به اهميت نمونه بيش از يك لام از نمونه تهيه مي‌گردد و اين تعداد بستگي به انواع رنگ‌آميزي لازم براي نمونه هم دارد. 
  لام‌ها را در شان‌هاي مخصوص لام قرار داده و به مدت يك ساعت در اتو 56 درجه قرار دهيد تا ضمن چسبيدن كامل نمونه‌ها (به علت انعقاد آلبومين) پارافين اضافي اطراف آن نيز ذوب و ريخته شود. بعضاً لام‌ها را به مدت چند دقيقه در 120 درجه قرار مي‌دهند تا سريع‌تر انجام شود ولي اين كار صحيح نيست و به بافت صدمه مي‌زند.

علل ناصاف بودن و سريال نبودن برش‌ها:

  كندي چاقو يا موازي نبودن چاقو
  شل بودن پيچ و مهره‌ها
  سختي بيش از حد پارافين
  دماي بيش از حد پارافين حين پاساژ يا گرم شدن بلوك پارافيني قبل از برش
  چسبيده بودن مقداري پارافين به چاقو (چاقو را پس از هر برش بايد با قلم موي نقاشي تميز نمود) 
  عدم آب گيري و شفاف كردن نامناسب و ناكافي
  آغشتگي ناكافي

پس از مراحل گفته شده نمونه آماده رنگ آميزي است ولي چون هنوز مقاديري پارافين در بافت موجود است بايد نمونه دپارافينه شود . اين عمل شامل ذيل است:
  گزيلل سه ظرف هر كدام 5 دقيقه 
  الكل 100، 95، 85 و 70 درجه هر كدام 5 دقيقه
  شستشو با آب
در واقع وقتي گفته مي‌شود نمونه تا آب آورده شود شامل موارد فوق است.

 
تهیه اسمیر از مایعات :
مایعات رقیق :
        نمونه را در لوله ی متوسط ریخته به مدت 10 دقیقه با قدرت g1000 سانتریفوژ نمایید ، مایع رویی را خالی نموده ته نشین را با ضربات آهسته تعلیق کنید ، روی چند لام میکروسکوپی تمیز هرکدام 50 میکرولیتز از مخلوط فوق ریخته به فطر یک تا دو سانتیمتر پخش نمایید ، پس از خشک شدن نسبی لامها را به مدت نیم ساعت در اتانول 95 درصد غوطه ور نمایید ، لامها آماده ی رنگ آمیزی است  .
مایعات غلیظ : 
      از نمونه مستقیما چند لام تهیه نموده ، از مابقی سل بلاک تهیه نمایید .
تهیه ی تاچ پرپ از بیوپسی مغز استخوان : 
نمونه ی بیوپسی را با پنست گرفته به آرامی به سطح لام تماس دهید ، سپس لامها را به روش غوطه وری در اتانول فیکس نمایید 
تهیه ی تاچ پرب از بافت های تازه : 
     با تیغ در نقاط مشکوک بافت برش بزنید ، چند عدد لام میکروسکوپی را به آرامی با سطح بافت تماس دهید ، لامها را فیکس نمایید

 
رنگ‌آميزي:
انواع رنگ‌آميزي‌هاي مختلف در پاتولوژي موجود مي‌باشد ولي رنگ‌آميزي هماتوكسيلين- ائوزين براي برش‌هاي بافتي، رنگ‌آميزي پاپائيوكلائو براي اكثر نمونه‌هاي سيتولوژي و رنگ‌آميزي‌هاي گروه رومانوفسكي براي بررسي سلول‌هاي خوني و لوكميك بيشتر استفاده مي‌شود ولي رنگ‌آميزي‌هاي ديگري نيز وجود دارد كه در ذيل فقط اشاره مي‌شود و مي‌توان به كتب مربوطه مراجعه نمود. 
• براي رشته‌هاي الاستيك: رنگ‌آميزي ور هوف- رزورسين فوشين- اورسئين
• براي رشته‌هاي كلاژن: رنگ‌آميزي وان گيسن- تري‌كروم ماسون
• براي رشته‌هاي رتيكولين: رتيكولين- جونز
• براي رشته‌هاي آهن (هموسيدرين): رنگ‌آميزي پرل
• براي رشته‌هاي مايكوباكتريوم‌ها: رنگ‌آميزي ذيل نلسون
• براي رشته‌هاي آميلوئيد: رنگ‌آميزي كنگورد
• براي رشته‌هاي گليكوژن: رنگ‌آميزي پاس PAS 
• براي رشته‌هاي موسين و كريپتوكوكوس: رنگ‌آميزي مايرموسي كارمن
• براي رشته‌هاي موسين: رنگ‌آميزي آلسین بلو
• براي هليكوباكتر: رنگ‌آميزي ماي گرونوالدگيمسا
• براي رشته‌هاي بررسي چربي: رنگ‌آميزي اسيداسميك- سودان سياه- سودان III

نكته: امروزه بسياري از رنگ‌ها بصورت آماده توسط شركت‌هاي توليد كننده موجود مي‌باشد ولي در صورت تمايل تمامي اين رنگ‌ها را مي‌توان در آزمايشگاه تهيه و آماده نمود. لذا ما در اين جزوه به روش ساخت رنگ‌ها نمي‌پردازيم.

فرضيه : 
بطور كلي امروزه معتقدند در رنگ‌آميزي تركيبي از عمل جذب و واكنش شيميايي بيش رنگ و اجزاء بافت باعث رنگ گرفتن بافت مي‌شود. 
انواع :  1) حياتي: سلول‌ها را در حالت زنده رنگ‌آميزي مي‌نمايند. 
 2) رنگ‌آميزي غيرحياتي: نسوج مرده را رنگ مي‌نمايند و اكثراً‌ اين نوع است.
اكثر رنگ‌ها جزو تركيبات بنزني هستند. اين رنگ‌ها به صورت طبيعي وجود دارند مانند كارمالين و هماتوكسيلین يا بصورت صنعتي سنتتيك تهيه مي‌شوند. هماتوكسيلين مهم‌ترين رنگي است كه در آزمايشگاه بافت شناسي و پاتولوژي استفاده مي‌شود و از مغز نوعي سرخس تهيه مي‌شود و بخودي خود رنگ دهي ندارد مگر آن را اكسيد و به هماتين تبديل نمايند.

 

 

 

رنگ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین (H&E)

آوردن نمونه ها تا آب ( دپارافینه ، گزیلل و آبدهی )
هماتوکسیلین                                             5-3 دقیقه
شستشو با آب                                               30 ثانیه 
رنگبری با اسید الکل                                      چند لحظه
شستشو با آب                                               30 ثانیه 
محلول کربنات لیتیم اشباع                           چند لحظه 
شستشو با آب                                               30 ثانیه 
پاک کردن بخشهای اضافه از روی لام
ائوزین                                                   1 تا 5 دقیقه 
آبگیری (الکل 70 و 85 ، 95 و 100 درجه) درجه: هر کدام 5 دقیقه
گزیلل 1 و 2 و 3                                 هر کدام 5 دقیقه
چسب و نصب لامل  
 نصب برچسب حاوی کد ، سال و شماره ی پاتولوژی
تذکر : زمانهای فوق پیشنهادی است و بسته به کیفیت رنگها متفاوت می باشد و هر آزمایشگاه باید با تجربه روی تعدادی برش آزمایشی زمان مطلوب خود را به دست آورد .

رنگ آمیزی پاپانیکولائو

شماره گذاری با قلم الماسه در ابتدا سال سپس شماره
الکل 95 درجه                                            10 دقیقه
آبدهی ( الکل 85 و 70 درجه )         هر کدام سه دقیقه
شستشو با آب                                              30 ثانیه
هماتوکسیلین                                             5-3 دقیقه
شستشو با آب                                               30 ثانیه
رنگبری با اسید الکل                                      چند لحظه
شستشو با آب                                               30 ثانیه
محلول کربنات لیتیم اشباع                           چند لحظه
شستشو با آب                                               30 ثانیه
آبگیری (الکل 70 و 85 و 95 درجه ) هر کدام سه دقیقه
5 دقیقه OG6
آبگیری (الکل 70 و 85 و 95 ) درجه هر کدام سه دقیقه
5 دقیقه EA50
آبگیری (الکل 70 و 85 و 95 )  درجه هر کدام سه دقیقه
گزیلل 1 و 2 و 3                                 هر کدام 5 دقیقه
مونته کردن ( چسب و لامل )

 

فرم درخواست پاتولوژی و سیتولوژی (فرم شماره یک کشوری)

آزمایشگاه پاتوبیولوژی .  .  .  .  
دکتر .  .  .  .   پاتوبیولوژیست     مدرس دانشگاه 
قزوین – خیابان .  .  .  .  .  .  .   تلفن : .  .  .  .  .    

شماره پاتولوژی :     -     -

 

اطلاعات هویتی : ( توسط منشی پر شود )
نام :                                نام خانوادگی :                                  نام پدر :                     جنسیت :
تاریخ  تولد:       /     /         (. . . سال) کشور :       استان :              شهر :                مدت سکونت(سال) :
شماره شناسنامه :                 کد ملی :                                           کد پستی :                                           نوع بیمه :                          شماره بیمه :                                       ملیت :                       
آدرس : استان :                  شهر :                                               روستا :                   
خیابان :                            کوچه :                                              پلاک :                            
تلفن ثابت:                         تلفن همراه :                                      تلفن بستگان :
تاریخ تکمیل :       /      /                    نام وامضاء تکمیل کننده :

اطلاعات بالینی : ( توسط پزشک نمونه بردار پر شود )
شکایت اصلی :                               مدت شکایت :               محل ضایعه :                        
علائم بالینی :
محل بیوپسی و تعداد:                                                سابقه بیوپسی قبلی از محل :  بله (   )    خیر (   )        
سابقه کانسر   : بله(   )     خیر(   )       نمیداند(   )    اگر بله نوع و محل آن :                   
سابقه متاستاز : بله (   )    خیر (   )    نمی داند (   )      
نتایج آزمایشات انجام شده  (تومور مارکرها حتما ذکر شود) :
نتایج رادیولوژی –  اندوسکوپی و دیگر اقدامات انجام شده : 
تشخیص بالینی یا پاراکلینیکی پزشک: 
نام پزشک :                                                  مهر و امضاء :

موفق باشید    -     دکتر خوئینی ها